基本的考慮因素。由于吸光度法技術(shù)上簡(jiǎn)單可靠,所用儀器價(jià)格合理,因此是目前酶活 測定中首選的方法之一。 當底物或產(chǎn)物是有顏色的,或者是在紫外區有光吸收的,吸光度法就可以非常快速和方 便地進(jìn)行,因為吸光產(chǎn)物的出現速率或者消失速率可以用分光光度法來(lái)跟蹤檢測。 催化活性z 對應于每分鐘的吸光度的變化為: z=(△AV³100)/ε d△t 式中,V 是測量體積,L;t 是時(shí)間,min;z 的單位是mol/min,對英語(yǔ)前面章節里給出的國 際單位制U 的定義。
吸光光度法是基于物質(zhì)對光的選擇性吸收而建立起來(lái)的分析方法,包括比色法、可見(jiàn)及紫外吸光光度法及紅外光譜法。吸光光度法是采用分光器獲得純度較高的單色光,基于物質(zhì)對單色光的選擇性吸收測定物質(zhì)組分的分析方法。
吸光光度法的方法原理
吸光光度法是借助分光光度計測定溶液的吸光度,根據朗伯一比耳定律確定物質(zhì)溶液的濃度。吸光光度法是比較有色溶液對某一波長(cháng)光的吸收情況。
吸光光度法的特點(diǎn)
A靈敏度高
一般吸光光度法所測定的下限可達10-5~10-6mol/L,因而有較高的靈敏度,適用于微量組分的分析。
B準確度較高
吸光光度法的相對誤差為2%~5%,采用精密的分光光度計測量,相對誤差為1%~2%,其準確度雖不如滴定分析法高,但已滿(mǎn)足微量組分測定的準確度要求,而對微量組分的測定,滴定分析法是難以進(jìn)行的。
C簡(jiǎn)便、快速
吸光光度法所使用的儀器——分光光度計,操作簡(jiǎn)單,易于掌握。近年來(lái),由于一些靈敏度高、選擇性好的顯色劑和各種掩飾不斷出現,常可不經(jīng)分離直接進(jìn)行吸光度分析,有效地簡(jiǎn)化了測量步驟,提高了分析速度。
D應用廣泛
幾乎所有的無(wú)機物和許多有機化合物都可直接或間接地用吸光光度法進(jìn)行測定。從外,該法還可用來(lái)研究化學(xué)反應的機理,以及溶液的化學(xué)平衡等理論。如測定配合物的組成,弱酸、弱堿的理解常數等。由于有機試劑和配位化學(xué)的迅速發(fā)展及分光光度計性能的提高。吸光光度法已廣泛用于生產(chǎn)和科研部門(mén)。
酶制劑相關(guān)產(chǎn)品
吸光度測定方法
1、單一組分的測定
①比較法。比較法是先配制與被測試液濃度相近的標準溶液c(S)、被測試液c(X),在相同條件下顯色、定容后,測其相應的吸光度為A和A(X),根據朗伯一比耳定律:
A(S)=ε(S)b(S)c(S) A(X)=ε(X)b(X)c(X)
由于同一物質(zhì),用同一波長(cháng)及相同厚度的吸收皿測定
ε(X)=ε(S) b(X)=b(S)
所以 A(S):A(X)=c(S):c(X)
即可求出待測試液的含量c(X)。
應當注意,進(jìn)行計算時(shí),只有當與相近時(shí),結果才可靠,否則將有較大誤差
吸光光度法的特點(diǎn)是:因入射光是純度較高的單色光,故使偏離朗伯一比耳定律的情況大為減少,標準曲線(xiàn)直線(xiàn)部分的范圍更大,分析結果的準確度較高。因可任意選取某種波長(cháng)的單色光,故利用吸光度的加和性,可同時(shí)測定溶液中兩種或兩種以上的組分。由于入射光的波長(cháng)范圍擴大了,許多無(wú)色物質(zhì),只要它們在紫外或紅外光區域內有吸收峰,都可以用吸光光度法進(jìn)行測定。
②標準曲線(xiàn)法
2、高含量組分的測定——示差法
3、多組分的分析
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